甲烷單加氧酶調(diào)節(jié)蛋白MMOB的結(jié)構(gòu)
化學先生 / 2019-07-30
調(diào)節(jié)蛋白B的分子量大約是16kDa,由7條β鏈構(gòu)成兩個β帶，這2個β 帶成直角，通過3個a螺旋，互相垂直交聯(lián)在一起，鄰接部分呈現(xiàn)螺旋趨勢，但較混亂。N端易受蛋白影響發(fā)生水解，N端水解后縮短了MMOB的鏈長度?；蛑亟M的MMOB與天然MMOB相比，和MMOH結(jié)合的親和性有所降低。甲烷羥基化反應(yīng)的效率，取決于MMOH和MMOB在催化過程中的相互作用動力學。整個蛋白質(zhì)表面呈現(xiàn)疏水性，在酶系統(tǒng)反應(yīng)中只對MMOH一些關(guān)鍵部位的結(jié)構(gòu)和功能起調(diào)節(jié)作用，沒有直接參與酶的催化反應(yīng)。Walters等[42]利用NMR譜，研究了Bath菌的MMOB高精度精細結(jié)構(gòu)譜，并觀察了在MMOR存在或缺少情況下，MMOB與MMOH的結(jié)合情況。
Chang等采用'H、PC、I5N標記的RNA異核糖核酸(heteronuclear)的2維、3維NMR譜，研究了含138個氨基酸的重組MMOB(OB3b)溶液結(jié)構(gòu)，通過脈沖場梯度NMR自擴散( pulse field gradient NMR self- diffusion)測定表明，MMOB的蛋白濃度在1mmol/L時主要以二聚體的形式存在，在低于0. 2mmol/L時主要以單體形式存在。分子折疊較好的部分氨基酸殘基為36~126片段，與類似蛋白相比較，來自于OB3b的MMOB是一個更緊密的蛋白質(zhì)，缺乏更大的環(huán)狀空穴。
調(diào)節(jié)蛋白B是一個單體，在2個較弱的位點與MMOH結(jié)合，在低濃度時，MMOB可使MMOH從一個氧化酶轉(zhuǎn)化為羥基化酶]，當MMOB的濃度使2個結(jié)合位點達到飽和時，MMOH的活性被削弱。由于MMOH的兩個雙核鐵中心處于由a、β亞基形成的谷底，相距1. 2nm, MMOR與MMOH的結(jié)合點可能在“谷”中，而MMOB則有可能結(jié)合在較深的谷下。后來經(jīng)過光譜、化學交聯(lián)、穩(wěn)態(tài)動力學、恒溫熱力學等研究，實驗結(jié)果支持這一假設(shè)。利用高分辨率的NMR探索MMOB分子表面的殘基、MMOB與MMOH的結(jié)合點以及MMOR對MMOH和MMOB結(jié)合的影響表明，約有10~12個氨基酸殘基隱藏在MMOB表面背后，很可能是它們在與MMOH結(jié)合中起主要作用。MMOB的分子表面有很多疏水殘基，使得MMOB與MMOH易于發(fā)生相互作用，MMOB的親和性隨著鹽濃度的增加而增加也同樣說明了這一點。由此推斷，MMOB與MMOH的結(jié)合，可能是由MMOB疏水表面與MMOH的a、β亞基對，形成的疏水腔相互作用的結(jié)果。在沒有MMOH存在下，NMR的研究表明，MMOB與MMOR并不發(fā)生相互作用，加人MMOH后，與MMOH的結(jié)合中也不相互競爭。總之，MMOB構(gòu)成了復雜的、不尋常的折疊，在相互作用中沒有直接與還原酶相互作用，而是與MMOH結(jié)合后，通過誘導變形發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。在沒有MMOB存在的情況下，MMOH與MMOR也能催化底物反應(yīng)，但反應(yīng)速率很低。MMOB一向被認為是通過形成特殊通道或增加某一區(qū)域部分結(jié)構(gòu)的靈活性，來控制底物進人到MMOH活性中心，實現(xiàn)底物、O2的轉(zhuǎn)化。Wallar 等[45]對MMOB殘基末端的四個氨基酸(N107G/S109A/S110A/T111A) 進行四倍突變發(fā)現(xiàn)，大大加速了甲烷與中間體Q的反應(yīng)速率。Brazeau 等[46]采用單倍、雙倍的MMOB基因突變研究顯示，突變后的MMOB在許多方面改變了MMOH的催化反應(yīng)性能，但與四倍基因突變情況有所不同。對比后認為，MMOB氨基酸殘基有可能構(gòu)成MMOB-MMOH復合物分界面的一部分，使底物更容易接近MMOH活性中心。特別是Thri的突變對催化反應(yīng)影響最大，由于Thr11的突變，甲烷與中間體Q的反應(yīng)速率常數(shù)降低，增大了乙烷、呋喃、硝基苯與中間體Q的反應(yīng)速率常數(shù)。Thr11突變型MMOB與天然酶相比，使反應(yīng)循環(huán)中的其它步驟減慢了十幾倍，硝基苯氧化的區(qū)域特征也發(fā)生了變化。因此認為，MMOB中的Thr1i是控制底物進人MMOH活性中心的關(guān)鍵組分，起著一個開關(guān)“閥”的作用。
為了進一步研究MMOH與MMOB的結(jié)合部位，MacArthur等采用SREPR (saturation-recovery EPR)譜研究了氧化態(tài)MMOH的雙鐵核中心，證明MMOB的結(jié)合改變了Fe2的交換對，結(jié)合這個結(jié)果與Fe2和Cys89之間的距離測定結(jié)果，可以推斷MMOB是直接結(jié)合到Fe2配基的a螺旋體上，引起了活性中心幾何構(gòu)型的改變。MMOB對氧化態(tài)MMOH有影響，這與前面觀察到的只對半還原態(tài)MMOH有影響不同，但沒有其它譜學方法證明這一點。只與氧化還原電勢的研究結(jié)果相一致。這意味著還原過程或與MMOB結(jié)合過程都伴隨著結(jié)構(gòu)的變化。
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