甲烷氧化菌的微生物學特征
化學先生 / 2019-07-27
1906年，Sohngen首先發(fā)現(xiàn)，在厭氧條件下生成的大量甲烷，釋放到大氣中以后其濃度大大降低。他認為，這可能是由于一些微生物或其它因素可以使甲烷分解造成的，繼之他就分離出世界上第一株甲烷氧化菌Bacillus meth-anicus。自此以后不斷有新的菌株被分離出來，到目前為止已發(fā)現(xiàn)了一百余株甲烷氧化菌?；诩毎螒B(tài)學分析、細胞體止期類型、細胞內(nèi)質(zhì)膜的精細結(jié)構(gòu)和一些生理學特性，Whittenbury將甲烷氧化菌分為五種類型，即甲基彎菌屬(Methylosinus)、 甲基孢囊菌屬(Methylecystis)、 甲基單胞菌屬(Meth-ylomonas)、甲基桿菌屬( Methylobacter)和甲基球菌屬(Meth ylococcus)。根據(jù)細胞代謝途徑，這些不同類型的菌株又被劃分為3個菌群:I型、II型、X型。近幾年來，又報道了5個新的甲烷氧化菌類型，如圖2-1所示。也有些報道將X型甲烷氧化菌歸人到I型菌中，因為它的表型和代謝途徑類似于I型菌，只是它含有低水平的絲氨酸代謝所需要的二磷酸核酮糖磷酸酶。
從內(nèi)質(zhì)膜的精細結(jié)構(gòu)看，I型菌主要含有圓盤狀堆積的內(nèi)質(zhì)膜束貫穿整個細胞，膜內(nèi)含有16碳脂肪酸，主要是通過單磷酸核酮糖(RuMP) 代謝途徑，代謝由甲烷經(jīng)甲醇轉(zhuǎn)化生成的甲醛，II型菌的內(nèi)質(zhì)膜排列在細胞外膜周圍形成環(huán)狀，膜中含有18碳脂肪酸，主要是通過絲氨酸(serine) 代謝途徑代謝甲醛。最近又有人報道，甲烷氧化菌也存在一種基于四氫甲酰氧嘌呤的C1代謝途徑，因此甲烷氧化菌如何代謝甲醇將有可能進一步討論。Bowman 研究比較了136個甲烷氧化菌中的124個菌的表型，他應用了大量的分類學研究方法，包括DNA-DNA雜交，脂肪酸組成分析，染色體的理化性質(zhì)和生物進化關系的分析，5S rRNA和16S rRNA的進化相關性分析。通過這些分析表明，能夠利用絲氨酸代謝途徑的甲烷氧化菌組成了獨特的ar Proteobacteria菌群，利用單磷酸核酮糖代謝途徑的甲烷氧化菌形成了r Proteobacteria 菌群，而且存在單磷酸核酮糖代謝途徑的菌不利用甲烷為碳源，從而構(gòu)成了另一類甲烷氧化菌β Proteobacteria菌群。
甲烷氧化菌是一類革蘭陰性菌，在利用甲烷為唯一碳源和能源方面是獨一無二的。幾乎所有的甲烷氧化菌都是依靠甲烷生長，也有個別甲烷氧化菌可以利用甲醇、甲胺、鹵代甲烷、含硫的甲基化合物和一些裂解的有機化合物中的甲基基團作為碳源。在甲烷氧化菌氧化甲烷的過程中，甲醛是這個代謝過程的重要中間體，細胞以吸收甲醛的形式作為碳源。幾乎所有的甲烷氧化菌都是專性甲烷氧化菌，但也有人報道，還存在個別的兼性甲烷氧化菌或限制性兼性甲烷氧化菌。不同屬、種的甲烷氧化菌有著不同的代謝一碳物質(zhì)的途徑和能力，它們的細胞結(jié)構(gòu)和化學組成也不同，因此也有不同的一碳 化合物的代謝調(diào)節(jié)機制。不同菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的需求能力，決定了該菌株在不同生長環(huán)境中的競爭能力。因此要理解甲婉代謝的控制因素和甲烷氧化菌的生態(tài)學，就必須了解不同甲烷氧化菌的生理學知識。
甲烷氧化菌在生理上和氨氧化菌有相似之處，它們氧化甲烷和氨氧化菌氧化氨的方式是非常相似的，自養(yǎng)生物氨氧化菌屬于β Proteobacteria菌群，也能夠氧化甲烷，但效率非常低。如前所述，甲烷的氧化主要發(fā)生在有氧的環(huán)境中，迄今沒有報道甲烷在厭氧環(huán)境中被微生物氧化的生物化學過程。
在自然界中，甲烷氧化菌分布于濕地、沼澤、河流的沉積物、稻田、海洋、池塘、被污染的土壤、落葉、森林、溪流、污水管道的沉積物中，也有一些與海洋動物臟器共生的甲烷氧化菌。目前，已被表征過的菌株均是專性甲烷氧化菌，它們均有固氮作用，已發(fā)現(xiàn)的甲烷氧化菌可能僅僅是自然界中很小的- .部分。隨著甲烷氧化菌檢測技術的進展，相信會有更多的、不同的甲烷氧化菌被發(fā)現(xiàn)。一般來講，甲燒氧化菌的檢測是利用氣相色譜測定其對甲烷的消耗。近幾年，利用免疫熒光抗體和核酸探針檢測的方法，或直接從環(huán)境樣品中克隆的分子生物學方法用來檢測自然界中的甲烷氧化菌也是非常有效可行的。
隨著分子生物學的發(fā)展，利用基因序列、微生物分類及微生物進化的關系鑒定甲烷氧化菌，也是近年來建立起來的新方法。例如，MeDonald等利用甲烷氧化菌中羥基化酶a亞基和甲醇脫氫酶組分A的基因序列設計的引物被用于篩選、鑒定環(huán)境中甲烷氧化菌的工作中，就像16S rDNA雜交探針用于菌株的篩選工作一樣準確、高效，因為當其它組分的變化較大的時候，這兩個組分是保守的11。甲烷氧化菌的pMMO與氨單加氧酶(AMO)的基因序列有較高的序列保守性，由此推斷甲烷氧化菌與氨氧化菌在生物進化關系上是密切相關的。但該方法有一個明顯的缺陷，不是所有的微生物都可以采用此方法來鑒定，因為在相同環(huán)境中同類微生物的基因序列可能并不都是保守的。通過脂肪酸鑒定微生物結(jié)構(gòu)也是有效的方法之一，特別是對于甲烷氧化菌的結(jié)構(gòu)鑒定是非常有用的。
甲烷氧化菌不能生存在單純的大氣環(huán)境中，因為大氣中的甲燒不足以支持其氧化反應和細菌的自身生長。只有在土壤和水的沉積物存在下，剛從厭氧細菌層中釋放出來的甲烷，才可以維持甲烷氧化菌的生理活動。目前被分離出來的甲烷氧化菌大多生活在室溫和中性環(huán)境中，其最適pH為3.5~8.0.近年來，也發(fā)現(xiàn)了一些在極端環(huán)境中生長的甲烷氧化菌，如熱溫泉、酸性的沼澤和南極條件下生長的菌株。在些湖泊中， 甲烷氧化菌存在 于厭氧層和有氧層之間，特別是有大量的菌株生長在植物的根陳附近，因為在那里有沉積層的甲烷在支持菌株的生長，并有來自于植物根部的氧，甲燒氧化菌的最佳生長環(huán)境是氧濃度為20%左右。在高氧濃度和低甲烷濃度環(huán)境中，將有利于I型甲烷氧化菌的生長，反之，則有利于II型甲烷氧化菌的生長。
甲烷氧化菌能催化生產(chǎn)單細胞蛋白和許多精細化學品的反應。它們不但能夠使厭氧菌產(chǎn)生的甲烷羥基化，而且可以使其它一些烷烴、烯烴和芳香烴發(fā)生選擇性氧化。甲烷單加氧酶是甲烷氧化細菌中的主要酶系，在常溫、常壓下，能夠催化甲烷轉(zhuǎn)化為甲醇的反應，然后在一系列脫氫酶作用下生成CO2和H2O:
在化學上實現(xiàn)從甲烷到甲醇的直接轉(zhuǎn)化是很困難的，因為甲烷是碳氯化合物中最難發(fā)生羥基化的一個底物。它的C- H鍵十分穩(wěn)定，鍵能為438. 8kJ/mol,離子化電位為12.5eV,質(zhì)子親和能4.4eV,酸性pK。=48。甲烷單加氧酶在細胞中有兩種不同表現(xiàn)形式:溶解性甲烷單加氧酶(soluble MMO,簡稱sMMO)和顆粒性甲烷單加氧酶( particulate MMO,簡稱pMMO)，它們都可以催化CH生成CH3OH。一般來講，在目前已發(fā)現(xiàn)的甲烷氧化細菌中均含有顆粒性甲烷單加氧酶，它具有較窄的底物專一性，附著在細胞內(nèi)質(zhì)膜上。但依靠生長環(huán)境中Cu2+的調(diào)節(jié)，一部分甲烷氧化細菌能夠表達溶解性甲烷單加氧酶，特別是在II型甲烷氧化細菌中，當Cu2+濃度較高時，pMMO得到表達;而Cu2+濃度較低時，sMMO得到表達。與pMMO相比，sMMO的作用底物較寬，活性高，表現(xiàn)出具有更寬的底物專一性，且存在于細胞質(zhì)中，可催化其它低碳烷烴的羥基化和低碳烯烴環(huán)氧化和脂肪烴、芳香烴的羥基化反應，以及一些環(huán)境污染物(如三氯乙烯等)的降解。正是由于這種寬底物專一性，人們認為sMMO在生物催化過程中會發(fā)揮更重要的作用。從而引起了許多科學家的興趣，并積極努力開發(fā)些新的烴類 選擇氧化過程和生物除污新方法，在能源、化工和環(huán)境保護方面，有著更為廣闊的應用前景[17]。迄今為止已對七種甲烷氧化細菌的sMMO進行了分離純化和表征: Methylocystis sp. WI14、Methylosinus trichosporium OB3b、Methylocystis sp. M、Meth ylococcus cap-sulatus Bath、 Methylobacterium sp. CRL 26、Meth ylosinus trichosporiumIMV 3011 和Methylomonas sp. GYJ3[18~25]。尤其對源于M. trichosporiumOB3b和M.capsulatus Bath 的sMMO進行了較系統(tǒng)的研究。1984年，Datono)從所研究的Bath 菌中得到了一個三組分復合酶體系:羥基化酶(MMO hydroxylase,簡稱MMOH),分子量為220kDa@,由三個亞基a、B、γ組成(aBY)2 二聚體，含2~4個Fe的金屬蛋白:調(diào)節(jié)蛋白B(MMOB)，分子量為14~17kDa，不含輔基和金屬蛋白;還原酶(MMO reductase, 簡稱MMOR),分子量為38~45kDa,含1個Fe2S2(鐵硫蛋白)和輔基FAD(flavinadenine dinucleotide,核黃素腺嘌呤核苷酸)的蛋白。其它的sMMO在結(jié)構(gòu)構(gòu)型上和它們都是非常相似的，都不含有血紅素，除了一個甲烷氧化菌Meth-ylobacteriumsp.CRL-26之外，其它菌株的sMMO也都是由三個組分組成的一個復合酶體系，含有雙核鐵活性中心，在這里分子氧被活化，一個氧插人到甲烷的C- H鍵中，形成甲醇，另一個氧形成水。與其它具有應用價值的酶相比較，顯然有關甲烷單加氧酶的基礎性研究信息是缺乏的。羥基化酶是sMMO催化活性的關鍵組分，也是酶催化反應的活性中心，對它的深入研究，有助于sMMO反應機理和其生物轉(zhuǎn)化、生物除污功能的深入研究。從MMOH的晶體分析看，雙核鐵活性中心位于距a、β亞基形成的谷底1. 2nm處。組分B是一個小分子調(diào)節(jié)蛋白，它對整個反應循環(huán)的反應速率、MMOH的結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)物的分布都有重要的作用，它的活性可能被肽鏈的N端水解所調(diào)節(jié)，在低濃度時，組分B調(diào)節(jié)羥基化酶從一個氧化酶成為一個羥基化酶，穩(wěn)定氧激活所必需的中間體，飽和量的組分B明顯增加了這個中間體，加速了甲烷到甲醇的轉(zhuǎn)化。組分C的功能是接受輔酶NADH電子，將電子傳遞到羥基化酶，含有[2Fe-2S]中心，能夠加速電子從NADH到活性中心的轉(zhuǎn)移。
美國Lipscomb、Lippard、 Newcomb和英國Dalton、Murrell 等教授從酶的生物學特征、分子結(jié)構(gòu)、催化功能、活性中心、反應機理和分子生物學等方面，對甲烷氧化菌和甲烷單加氧酶進行了深入的基礎研究。研究較為全面面深人的菌株是Meth ylococcus ca psulatus Bath, Meth ylosinus trichosporiumOB3b.自20世紀80年代中期開始，我國趙樹杰、李樹本、邢新會等教授，也先后開展了甲烷氧化菌的篩選和甲烷單加氧酶催化化學與功能模擬的研究工作。不但成功地篩選了多株甲烷氧化細菌，并進行了酶和細胞的固定化，以及丙烯環(huán)氧化制環(huán)氧丙烷，甲烷生物催化氧化制甲醇和三氯乙烯(TCE)降解等生物催化反應研究。從酶化學水平揭示了甲烷單加氧酶對分子氧和小分子烴的活化機理，取得了一系列進展。
和化學催化相比，生物催化過程也存在著某些固有的弱點，如作為生物催化劑的酶在催化循環(huán)中自身不夠穩(wěn)定、催化效率低，以及輔酶難以再生等。這些因素都嚴重影響著生物催化反應循環(huán)的連續(xù)性，制約了當前酶化學的發(fā)展和酶催化在化學工業(yè)中的應用。近幾年，隨著分子生物學技術的日益成熟和迅猛發(fā)展，利用基因工程技術構(gòu)建、改造的工程菌，有可能改善天然酶的性質(zhì)或使其具有新功能，為解決生物催化中存在的這些國際性的技術難題開辟了新途徑。然而，和醫(yī)學、農(nóng)業(yè)相比，分子生物學在化學化工中的應用研究進展還非常緩慢。
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