吸附劑的標(biāo)準(zhǔn)化如前所述，吸附劑表面包含有各種強(qiáng)度的吸附部位。就硅膠而言，這些部位可從弱的部位(硅氧烷)到中等強(qiáng)度部位(游離能醇)直到強(qiáng)的部位(分子內(nèi)氫鍵硅醇)不等。吸附劑的活性歸四于這些部位中可用于色譜相互作用的相對(duì)有效數(shù)目。對(duì)于非極性流動(dòng)相(如已烷)和非極性溶質(zhì)(如多核芳烴)，因?yàn)槲侥?/span>最弱，所以高度活潑的表面比較合適。對(duì)于非極性流動(dòng)相和極性溶質(zhì)(如醇類)，則要求用減活的表面，因?yàn)槲侥軓?qiáng)。
在活潑的吸附劑上,吸附劑與極性溶質(zhì)的強(qiáng)烈相互作用引起長(zhǎng)的保留時(shí)間和(或)峰的拖尾，極端情況下可能發(fā)生不可逆的吸附(例如羧酸類在活性氧化鋁上)。色譜效率和線性容量?都很低。為控制吸附劑的活性，可加入水分以選擇性地覆蓋或阻塞吸附劑表面活性最強(qiáng)的部位。吸附劑的含水量可以在裝柱之前預(yù)先調(diào)節(jié)，但用高性能的LSC填充物時(shí)，通常是在裝填好的柱中憑借流動(dòng)相進(jìn)行改性更為方便。對(duì)于非極性流動(dòng)相，合適的含水量是非常重要的，但當(dāng)流動(dòng)相的極性增大時(shí)，含水量的重要性就減小了[13].
為了調(diào)節(jié)未裝填吸附劑的含水量，可將填充物加熱4~8小時(shí)以除去表面的殘留水分。硅膠通常加熱到125~150℃?，氧化鋁則需要200~400℃。使吸附劑在密閉的容器中冷卻，然后加入已知量的水。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定[13]， 硅膠每平方米表面積含水0.02~
0.04克時(shí)有最大的線性容量。此數(shù)量相當(dāng)于單分子層的50~75%。對(duì)于多孔吸附劑如LiChrosorb TM,按重量比約占8~10%。對(duì)于多孔層微珠則要求較小的量，按重量比約為0.5~1.5%。水以液體狀態(tài)加到密閉的容器中。旋轉(zhuǎn)容器直到吸附劑濕塊完全散開。最后將容器放置一-段時(shí)間(最好過夜)，使水分均勻分布在全部吸附劑中。將吸附劑標(biāo)化，即可準(zhǔn)備充填。標(biāo)化后的吸附劑必須防止曝露于空氣，因?yàn)樗芘c大氣中的水分重新平衡。
吸附劑的含水量在使用過程中必須不發(fā)生變化。流動(dòng)相中必須含有控制量的水分。如果流動(dòng)相太“干燥”，則當(dāng)流動(dòng)相連續(xù)流過吸附劑時(shí)，后者中的水分將被帶走。吸附劑的活性將變得更大，而溶質(zhì)的ke'值將隨著時(shí)間而增大。另一方面，如果 流動(dòng)相太“潮濕”，多余的水分將吸附在填充物上，進(jìn)一步使之失活。保留時(shí)間將降低，選擇性也可能發(fā)生變化。只有當(dāng)流動(dòng)相與失活的吸附劑之間完全達(dá)到熱力學(xué)平衡時(shí)，保留時(shí)間才能夠重現(xiàn)。
使含水量最適化的方法雖然簡(jiǎn)單，但操作卻很冗長(zhǎng)費(fèi)時(shí)。先注入ke'值約為1~5的標(biāo)準(zhǔn)溶質(zhì)或測(cè)試樣品，并測(cè)定其保留時(shí)間(或洗脫體積)。再進(jìn)行第二次樣品注射，如果 保留時(shí)間改變了，即是含水量沒有平衡。第二次注射的保留體積較低時(shí)，說明溶劑太“潮濕”，假如保留體積較高，就是溶劑太“干燥”。這種實(shí)驗(yàn)易于由雙泵式梯度型液相色譜儀來(lái)完成，因?yàn)楦傻娜軇┛?/span>置于一個(gè)泵系統(tǒng)中，水飽和的溶劑則盛放在另一個(gè)泵中[4]。能夠進(jìn)行各種配比混合，并注射標(biāo)準(zhǔn)樣品。當(dāng)流動(dòng)相的含水量有巨大變動(dòng)時(shí)，需等待一些時(shí)間，因?yàn)槠胶饪赡芟喈?dāng)緩慢，對(duì)于非極性的溶劑例如已烷更是如此。研究表明[25\26]，對(duì)于這樣的非極性流動(dòng)相,當(dāng)從50%水飽和溶劑改變到75%水飽和溶劑時(shí)，需要250~300倍于柱體積的溶劑。對(duì)于0%或100%飽和的二氯甲烷，共至必須使更大量的溶劑通過柱子[25a]。幸而任何一種已知飽和度的與水不互溶的溶劑，都可用來(lái)平衡吸附劑[13]。于是，一種水溶性高的平衡溶劑(如乙醚)可用來(lái)代替水溶性低的溶劑(如已烷)。
水飽和溶劑，尤共是非極性溶劑，需要特定的制備方法。因為溶解的速度非常慢，以及小水滴有時(shí)形成霧珠，所以不能只是與水一起攪拌。制備水流動(dòng)相的辦法是將溶劑濾過含水30%的30~60目硅膠柱。如果溶劑不發(fā)生反應(yīng)，則將溶劑通過30~60日的干分子篩柱即可得到干的流動(dòng)相。
由于制備水飽和溶劑的困難，一些工作者[4、25~29]寧愿用加人小量(0.1~0.5%)的醇類，例如加入異丙醇。這一極性改性劑與水的作用相同，但更易溶于非極性溶劑。在程序變?nèi)軇┑牟僮髦?，一次梯度洗脫結(jié)束之后，吸附劑必須再生(即恢復(fù)到其起始狀態(tài))。在洗脫的終點(diǎn)，較強(qiáng)的流動(dòng)相與吸附劑處于平衡狀態(tài)。為了恢復(fù)起始條件，必須由較弱的流動(dòng)相來(lái)置換較強(qiáng)的流動(dòng)相。有時(shí)，強(qiáng)流動(dòng)相可引起吸附劑含水量的顯著變化。再生的辦法是: (1)使起始的流動(dòng)相流過柱子，直到
獲得起始的活性，或(2)按時(shí)間的函數(shù)減低流動(dòng)相的強(qiáng)度(即. deº/dt )進(jìn)行梯度回掃。由逆向的梯度進(jìn)行逐步再平衡，已經(jīng)證明比立即回到起始條件的辦法更為快速[7\42]。圖5-9所示為受L酚抗氧化劑的程序變?nèi)軇┓蛛x的一種色譜圖。
實(shí)用上的問題高度活潑的吸附劑可能導(dǎo)致不可逆的樣品吸附或變化。硅膠是微酸性的，能強(qiáng)烈保留鹼性化合物。有時(shí)，制備過程中殘留的無(wú)機(jī)酸(見前面章節(jié))可能引起對(duì)酸敏感的化合物發(fā)生反應(yīng)。未經(jīng)酸洗的氧化鋁是堿性的，因此，對(duì)堿敏感的化合物不應(yīng)在其上作色譜展開。經(jīng)水失活的吸附劑可能會(huì)更“溫和”。不可逆地吸附的化合物積累于柱的頂端，可能引起柱性能改變。解決的辦法是使用吸附劑與分析柱相同的前置柱，并定期更換。在注射“臟”樣品時(shí)，前置柱(或防護(hù)柱)也非常有用。
雖然薄層色譜( TLC )對(duì)于預(yù)測(cè)LSC的吸附劑、流動(dòng)相及操作條件是很有用的，但某些薄層板上的粘合劑可能影響TLC的結(jié)果。當(dāng)采用單一溶劑時(shí)?？芍苯訌腡LC推廣應(yīng)用到柱上;混合溶劑系統(tǒng)則有時(shí)出現(xiàn)困難。各溶劑對(duì)于干的吸附劑常有不同的親和
性，因而在TLC板上發(fā)生分離。流動(dòng)相的這種分離導(dǎo)致Rf值與柱的k’值稍有不同。此外，預(yù)先經(jīng)流動(dòng)相滿溫的柱子是以洗脫方式操作的，而TLC板則是以開放床方式運(yùn)行，并且在樣品組分離開板床之前分離就已中止。一種成功的從TLC外推到LSC的分離示于圖5-10。注意，侗氮化合物的洗脫順序是根據(jù)偶氦苯基本結(jié)構(gòu)上取代官能團(tuán)的相對(duì)極性。柱上的分離時(shí)間是5分鐘，TLC的展開時(shí)間則為50分鐘。注意，TLC不能分辨的硝基取代異構(gòu)體(化合物4和5 )在柱色譜中可以完全分離。另外，HPLC可由
簡(jiǎn)單地測(cè)定峰面積(或峰高)而易于對(duì)各峰進(jìn)行定量，若在TLC板上則須相當(dāng)費(fèi)時(shí)地測(cè)定斑點(diǎn)。
吸附劑通常極為穩(wěn)定，可反復(fù)應(yīng)用而不致變質(zhì)。各批產(chǎn)品之間的不重復(fù)性也會(huì)成為問題。產(chǎn)品的一致性甚為重要，因?yàn)樵S多例行方法可能是用特定的固定相，花費(fèi)了不少勞動(dòng)研究出來(lái)的，所以有賴于商品吸附劑質(zhì)量的長(zhǎng)期穩(wěn)定。早先，商品吸附劑在這方面曾經(jīng)是名聲極壞，但近來(lái)制造商已改進(jìn)了他們的產(chǎn)品。即使如此，變化仍然存在，因此，貯存一批優(yōu)質(zhì)吸附劑的做法值得推薦。吸附劑特性的微小變動(dòng)可由調(diào)節(jié)其含水量而得到補(bǔ)償。
溶劑純度在LSC中特別重要。前面已經(jīng)詳細(xì)討論了溶劑含水量的影響。其它極性雜質(zhì)可能影響柱的穩(wěn)定性或洗脫體積。它們可能在柱頂積累而引起沾污，并改變柱的吸附特性。顯然，含有紫外活性雜質(zhì)的溶劑不宜用于吸收型檢測(cè)器。即使是痕量雜質(zhì)，
只要具有極性，就可能在柱頂端積累起來(lái)。如果溶劑強(qiáng)度增大，例如梯變洗脫時(shí)，它們可能在色譜圖上形成無(wú)法解釋的峰。有時(shí)，溶劑在使用前必須進(jìn)行精制。雖然蒸餾可以去除高沸點(diǎn)化合物，但最好的精制方法是使溶劑通過大顆?；钚怨枘z柱。同樣也可在泵和進(jìn)樣器之間安裝一個(gè)填充有活性硅膠的前置柱。
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