甲烷單加氧酶中組分D-orfY的發(fā)現(xiàn)與功能和定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)研究
化學(xué)先生 / 2019-07-29
1：甲烷單加氧酶中組分D-orfY的發(fā)現(xiàn)
在第一個(gè)甲烷單加氧酶的基因序列測(cè)定中，就發(fā)現(xiàn)在整個(gè)基因序列申有一個(gè)小的開放閱讀框，編碼為orfY,但迄今尚未從甲烷氧化細(xì)菌中分離出該蛋白，對(duì)它的功能也不清楚。該基因位于mmoZ與mmoC之間，分子量約12kDa，稱為MMOD,如圖2-2所示。Merkx 對(duì)這個(gè)位于mmoZ與mmoC之間，功能未知的片斷orfY,在E.coli 中進(jìn)行了克隆表達(dá)，獲得了純的MMOD蛋白，通過(guò)WestenBolt分析，在Bath中確有MMOD存在。一個(gè)可能的解釋是該蛋白組裝在MMO雙鐵核中心內(nèi)，其功能是通過(guò)MMOD與MMOH結(jié)合，對(duì)MMO的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，如對(duì)丙烯環(huán)氧化反應(yīng)有一定的抑制作用，即MMOD有抑制MMO活性的功能。將二倍的MMOD添加到MMOH中，可使MMOH的UV光譜發(fā)生明顯變化，證明了該蛋白有可能組裝在MMOH雙核鐵中心內(nèi)。
2：甲烷單加氧酶的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)
2002年，Callaghan[57]等發(fā)表了 針對(duì)組分B的不穩(wěn)定性原位突變?cè)囼?yàn)結(jié)果。他們發(fā)現(xiàn)，由于組分B的N端12個(gè)氨基酸水解，造成了MMO的失活，其中最敏感的氨基酸殘基是Ser4-Tyr7.當(dāng)這些氨基酸殘基被突變后，水解速度明顯降低，組分B的穩(wěn)定性提高;當(dāng)這些氨基酸殘基被去除后，發(fā)現(xiàn)對(duì)MMO的活性產(chǎn)生很大影響;說(shuō)明這些氨基酸殘基對(duì)MMO的活性和組分B的穩(wěn)定性是必需的。使這些必需的氨基酸發(fā)生水解的原因，可能是組分B內(nèi)在的親質(zhì)子活性，而在培養(yǎng)基中添加Cu2+之后，可使sMMO失活，但并未抑制組分B的水解。Brandstetter 對(duì)Bath菌的MMOB進(jìn)行突變發(fā)現(xiàn)，在組分B的N端，Serl-Ala25 是不穩(wěn)定的，易發(fā)生水解，因此他們將Gly10突變?yōu)锳la, Gly13突變?yōu)镚In, Gly16 突變?yōu)锳la,結(jié)果水解被抑制。在這一工作中，他們使用pkk223-3質(zhì)粒和E.coliJM105宿主，pET-15b 質(zhì)粒和E. coli BL21宿主進(jìn)行突變體的表達(dá)。
3：顆粒性甲烷單加氧酶的分子生物學(xué)研究
對(duì)Bath菌的pMMO基因序列也有人進(jìn)行了基因測(cè)序和克隆表達(dá)，發(fā)現(xiàn)三個(gè)亞基是pMOC、pMOA和pMOB,其基因序列與固氮菌中的氨單加氧酶基因序列非常相似，這說(shuō)明它們?cè)谶M(jìn)化中是密切相關(guān)的。Mtrichos porium OB3b和Methylocystis sp. M的全部pMMO基因序列已被克隆，它們由2個(gè)相同的單體組成，與氨單加氧酶序列的相似性相當(dāng)高，有42% ~ 87%的基因序列同一性和58%~95%的氨基酸序列同一性。1999年Stolyar將構(gòu)建的Bath菌染色體插人突變菌株，發(fā)現(xiàn)pMOC和pMOA亞基是高度疏水性的，pMOB有2個(gè)跨膜區(qū)，表現(xiàn)出對(duì)E. coli宿主的毒性作用。因此，pMMO在異型宿主中表達(dá)可能比較困難，但它的基因序列信息可作為基因探針，用來(lái)檢測(cè)自然界中甲烷氧化菌的存在與多樣性。
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