單分子光譜
化學(xué)先生 / 2019-09-02
早在量子力學(xué)建立的初期，著名的諾貝爾獎獲得者Feyneman就夢想著能在原子、分子尺度上觀察和操縱物質(zhì)世界，然面多年以來，人們對微觀世界的觀測和研究都是建立在系統(tǒng)平均(system average)的基礎(chǔ)上。直到20世紀(jì)80年代掃描隧道顯微鏡、熒光探針、光鑷技術(shù)等的出現(xiàn)，進(jìn)人20世紀(jì)90年代單分子科學(xué)的形成與發(fā)展才使人們真正實現(xiàn)了Feyneman的夢想。
顧名思義， 單分子光譜就是單個分子的光譜，實際上通常是對單個生 物分子動態(tài)行為的光譜分析。那么為什么要進(jìn)行生物單分子光譜的研究呢?因為在普通的光譜技術(shù)中，實驗中探測到的是大量分子的綜合平均效應(yīng)，得到的是系統(tǒng)的平均響應(yīng)和平均值，這一平均效應(yīng)掩蓋了許多特殊的信息。而單分子光譜研究可以排除系統(tǒng)的平均效應(yīng)，有利于復(fù)雜環(huán)境中同種分子不同行為的分析，通過對體系中的單個分子進(jìn)行研究，從而得到單分子體系的動力學(xué)過程。例如，可以實時了解生物大分子構(gòu)象變化的信息:可以觀察微環(huán)境對單分子體系的影響，從面得到與分子微環(huán)境相關(guān)的信息。目前主要的技術(shù)手段包括生物大分子熒光光譜，單分子熒光能量轉(zhuǎn)移譜，與原子力顯微鏡結(jié)合進(jìn)行單分子水平的分子間相互作用力的測量，以及可進(jìn)行單分子操作的激光光鉗，高時間分辨率的單分子軌跡追蹤等。
熒光單分子檢測技術(shù)是用熒光標(biāo)記來顯示和追蹤單個分子的方法。1976 年，Hirschfeld檢測到標(biāo)有80~100個發(fā)光團(tuán)的單個抗體分子，開創(chuàng)了單分子檢測的先河。1994 年Moerner首先在水容器風(fēng)干表面對單熒光團(tuán)進(jìn)行顯像觀測，1995 年Funatsu 等又利用全內(nèi)反射顯微鏡(total internal reflection microscopy, TIRFM) 在水溶液中觀察到單個熒光基團(tuán)標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子，井追蹤其運動軌跡，真正實現(xiàn)了SMS對單熒光分子的檢測。由于熒光信號測量靈敏度高以及光子對分子干擾最輕微，SMS被廣泛應(yīng)用于單分子研究。尤其對于需觀察細(xì)胞內(nèi)單分子實時變化的細(xì)胞生物學(xué)研究，SMS可能是唯-有效的技術(shù)。
單分子熒光探測必須滿足兩個基本要求:一是在被照射的體積中只有一個分子與激光發(fā)生相互作用;二是要確保單分子信號大于背景的干擾信號。背景信號來自于Raman散射、Rayligh散射、溶劑中雜質(zhì)、蓋玻片的背景熒光和探測器的暗電流。因此，行單分子探測要求:①激發(fā)容積要小，因為背景的吸收與激發(fā)體積成正比，盡量減小激發(fā)體積可降低背景干擾;②高效的收集光學(xué)系統(tǒng);③靈敏的探測器;④采用針孔裝置，或?qū)⑷軇┲须s質(zhì)預(yù)漂白以及用低熒光光學(xué)材料等方法清除背景熒光。
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