天然產物的分離方法一一結晶法
化學先生 / 2019-07-26
使天然產物結晶的最實用方法是讓其從溶液中析出，結晶過程包括:①使含有一種或幾種所需化合物的溶液達到過飽和;②形成晶核;晶體生長。結晶過程實質上是一個碰撞過程，分子相互碰撞形成簇晶，即晶核,然后此晶核逐漸生長為具有特征性內部結構和外部形狀的結晶。攪拌和過飽和程度等因素都能對結晶過程產生影響。
將晶體溶于溶劑后，又重新從溶液中結晶的過程稱為重結品。重結晶可使不純的物質得到純化，也可使混合組分彼此得到分離。選擇重結晶溶劑的原則是使目標化合物具有適當?shù)娜芙舛龋^大和過小都不合適。化合物的溶解性隨溶劑變化顯著，混合溶劑的使用是將溶解度調節(jié)到所需水平的一種方便的方法。 在溶劑極性和重結晶溫度的選擇上有很大的靈活性。
如果樣品化合物量充足，可取一些樣 品溶解于結晶溶劑中制備飽和溶液,然后逐漸加人樣品至不能再溶，也就是飽和點。必須注意樣品的飽和度一般隨溫度升高而增大。 當只有少量的化合物樣品時，可采用混合溶劑法。先將化合物溶于溶劑1，然后逐滴加人第二種可與之混溶的溶劑2.化合物在混合溶劑中的溶解性應比在單獨的溶劑1中稍差。當溶液第一次變渾濁(即剛好過飽和)，加一滴溶劑 1使溶液澄清.此時接近于飽和點。過濾除去較大的污染物顆粒，再采用蒸發(fā)或冷卻方法使溶液達到過飽和。蒸發(fā)操作通常在室溫下進行，可將溶液敞開置于空氣中或者在其表面覆蓋打孔鋁箔減慢其蒸發(fā)速度;也可以直接將氮氣以緩慢流速引人溶液表面，加快揮發(fā)速度。
溫度對結晶形態(tài)和純度有著直接的影響。以酒石酸鐵鈉的外消旋體水溶液的結晶為例，當結晶溫度在28C以下時，右旋和左旋體分別結晶析出,但當結晶溫度高于28C時，形成外消旋混晶。而且，對映異構體單獨結晶含4個結晶水，而外消旋化合物結晶含1個結晶水。1848年Louis Pasteur就是利用重結晶實現(xiàn)了酒石酸銨鈉的手性分離，成為利用固態(tài)多晶型進行手性分離歷史范例。需要提及的是這個范例肯定不是唯一的。事實上，多晶型現(xiàn)象廣泛存在于有機化合物中，而且溫度對從溶液中獲得的有機化合物晶體的多晶形態(tài)的形成常有著重要的影響。
通常,有機小分子的溶解度隨溫度降低而下降。通過控制冷卻的速度和程度，即控制過飽和程度，來控制成核速度和晶體生長速度。冷卻速度可以用水浴來控制，而且可以簡單地通過觀察成核及生長情況來調節(jié)快慢。若形成微品,則表示冷卻速度過快，過多晶核的迅速形成，將最終導致生成大量微小的晶體。因此，減緩結晶生長，防止形成多余的晶核有利于形成較大的晶體，尤其是在單品培養(yǎng)中更應該嚴格控制晶核的數(shù)量。
減緩溶劑蒸發(fā)和冷卻的其他重要方法包括:蒸氣擴散法溶劑界面擴散法和熱梯度法等。蒸氣擴散法利用了一種獨特的溶劑混合系統(tǒng)，達到了比滴加溶劑更慢的溶劑混合效果。一般操作過程為:①將樣品置于.個小試管中,加人足夠 量的溶劑1制成近飽 和溶液;②將試管置于-個較大的燒杯中，在燒杯中加人適量的可與溶劑1混溶的溶劑2后,將其密封;溶劑2應有足夠的揮發(fā)性擴散人溶劑1中,形成一個混合溶劑體系，化合物在此混合溶劑中的溶解性比單用溶劑1要差;③蒸發(fā)溶劑1將有助于過飽和溶液的形成。雖然蒸氣擴散過程事實上增加了重結晶溶液的體積,但由于其避免了形成大量晶核而具有應用優(yōu)勢。理想的溶劑2應該具有更好的揮發(fā)性,并且與溶劑1相比對重結晶化合物的溶解性稍差。溶液界面擴散法與蒸氣擴散法類似，能實現(xiàn)比滴加溶劑更慢的溶劑混合效果。首先將小體積的溶劑1加人一細玻璃 毛細管中，如用于測定熔點NMR分析或X射線粉末衍射的細玻璃管中;然后使用一支注射器,將密度較小的溶劑2小心滴加于溶劑1的表面,樣品可溶于兩者間任意一種溶劑中。 假如界面溶劑混合程度誘導了過飽和，將觀察到在界面上晶體的生長。熱梯度法是將固體與溶解性相對較差的溶劑接觸，加熱溶解后經對流/擴散,溶劑攜帶溶質進人較冷區(qū)域時產生結晶。高質量的X射線衍射結構測定用單晶的培養(yǎng)必須限制在有限數(shù)量的品核內，經過幾天非震動環(huán)境下速度緩慢的生長才能完成。
結晶作為一種分離方法,其原理 相當簡單。例如，假設我們得到的產物包括目標化合物A和混有的雜質B和C.則可進行如下結晶分離①選擇溶劑使B和C在任意溫度都可溶，而組分A不是，將混合樣品溶解于熱溶劑中;②冷卻溶液析出一部分 A,與組分B和C分離:③重復步驟①和②的操作,每次使用新溶劑，直至達到分離的純度要求(通常從混合物中經一步結晶不能保證結晶產物的化學純度)。這個方法的缺點是損失可能較大，而且對于少于100 mg的樣品，色譜技術可能是更為合適的分離方法。對于上述分步結晶方法,需要考慮目標化合物的回收率時可以按下列操作步驟進行:①將目標化合物結晶并保留濾液;②將結晶溶解于新溶劑中:③重結晶產物并保留濾液;④濃縮步驟①中產生的濾液，得到的結晶溶于步驟③的濾液中重結晶。這個簡單的順序充分利用了兩次的濾液來獲得二次結晶產品。當然,可以將目標化合物結晶，雜質留在溶液中，例如，將20 ml紅辣椒或辣椒粉的乙醚提取物濃縮液用60 ml.石油醚稀釋后,冰箱中放置24 h,則析出幾乎純的辣椒紅素晶體。也可以將雜質結晶，目標化合物留在溶液中;例如，在生產藥用魚肝油時，飽和?；视腿缬仓岣视王タ梢酝ㄟ^冷卻以沉淀的形式從粗魚肝油中濾除，不飽和?；视土粼谌芤褐?。
過飽和溶液常放置很長段時間 而不產生結晶。如果不是純度問題，可以嘗試下列操作:①雖然過度的攪動可產生相反的影響，但攪拌可以通過增加溶液的碰撞頻率而增強成核作用;②結晶可能在外來物表面生長,可以將三角瓶敞口置于有灰塵空氣中，這是刺激結晶所需要的，如果有晶種就更為有利;③將熱溶液過濾進一-冷 的三角瓶中,以達到快速冷卻的目的，這經常足以誘導快速結晶，而且用刮具使玻璃三角瓶內璧粗糙同樣會有幫助;④溫度交替變化可能是有利的。過飽和溶液冷卻至冰箱的冷藏或冷凍室溫度，以降低溶解度，并且希望誘導成核，然后升至室溫，促進晶核生長為結晶。這樣做防止了因過分冷卻而增加溶液黏度，從而導致阻礙結晶進程的可能性。
如果只有少量的化合物用來結晶，則可考慮蒸氣擴散技術,這種技術適合于毫克量級物質的結晶。特別是在此基礎上發(fā)展出的懸滴法，被證明對于結晶毫克量級的蛋白質是一種非常受歡迎且有效的方法。從原理上看，懸滴法不僅限于大分子，而且也是前面所描述分離方案的簡單改造，值得用少量的天然產物來嘗試。將化合物溶于1滴溶劑1中,并且此液滴懸浮于蓋在盛有溶劑2的容器上方的玻璃蓋玻片上,蠟封體系避免溶劑揮發(fā)。蒸氣擴散造成了過飽和并且希望結晶生長?？梢杂^察到生長于懸滴中的結晶并且方便的回收,這種方法已經被用于在體積低至5~15 pL的液滴中生長蛋白質晶體，懸于500 μL體積的容器上。當只有少量化合物時(約5 mg),液體擴散和熱梯度方法同樣是有用的。
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