洗脫
抖化學(xué) / 2022-11-17
一旦吸附劑制成之后，可以用兩種方式使之作為分離系統(tǒng)使用。對(duì)于更成熟的色譜法，則需用常規(guī)的柱方法。然而分批分離則簡(jiǎn)單地包括將混合物與吸附劑淤漿共同保溫，在燒結(jié)板上過(guò)濾以除去吸附劑，這常常是合適的，這樣就免去了耗費(fèi)時(shí)間的柱的填充和平衡。
如果選用柱系統(tǒng)，洗脫就可用很多方法來(lái)完成。通?？梢哉业揭环N物理參數(shù)如pH或離子強(qiáng)度的適當(dāng)?shù)拇蠓茸兓蛘呤欠侄蔚幕蛘呤翘荻鹊?。曾?a href="http://yuehuifs.cn/goods.php?id=483">脲或鹽酸胍這類變性劑來(lái)洗脫被強(qiáng)烈吸附的、可再生的蛋白質(zhì)。有時(shí)，特別是當(dāng)涉及到免疫吸附劑時(shí)，其親和性極大以致根本不能使用常規(guī)洗脫法。在這些情況下，人們可借助于使用可降解的間隔基“手臂”。偶氨橋鍵很有用，因?yàn)樗鼈兛梢栽谶B二亞硫酸鹽還原作用的溫和條件下斷裂。為了促進(jìn)從抗球蛋白免疫吸附劑上回收淋巴球細(xì)胞，可使用明膠間隔基，在B淋巴球的生物吸附之后，該間隔間即可用骨膠原酶消化掉，從而釋出具有充分細(xì)胞活性的免疫球蛋白群。最高超的洗脫法還在于進(jìn)一步利用生物特異性。洗脫劑中含有過(guò)量的配位體，它就與固定的配位體競(jìng)爭(zhēng)吸附的分子。這種類型洗脫的功效強(qiáng)烈提示，生物親和色譜法比非特異的效應(yīng)優(yōu)越。下面討論的包含一般配位體的此技術(shù)的一個(gè)方面，生物洗脫起重要的作用。
等度洗脫
等度洗脫又稱無(wú)梯度洗脫，恒溶劑洗脫。在色譜洗脫過(guò)程中，是流動(dòng)相的組成保持不變的洗脫方法。
高效液相色譜儀是一個(gè)強(qiáng)有力的分離分析工具，但是作為洗脫用的流動(dòng)相并不單純是一種溶劑，而由兩種或兩種以上的溶劑(或緩沖液)以不同百分比組合而成。例如：甲醇-水、乙腈-磷酸緩沖液和己烷-乙酸乙酯等，以不同百分比組成流動(dòng)相。如果洗脫過(guò)程中溶劑的混合組成不變，就稱作等強(qiáng)度洗脫，即溶劑強(qiáng)度保持不變。如果洗脫過(guò)程中溶劑的混合組成隨時(shí)間變化，稱作梯度洗脫。依照溶劑強(qiáng)度隨時(shí)間變化的梯度洗脫技術(shù)在液相色譜中是十分有用的，不少難分離的物質(zhì)對(duì)以及極性相差較大的混合物需要依據(jù)梯度洗脫得到分離：
梯度洗脫
對(duì)于組分復(fù)雜的樣品，采用單一的流動(dòng)相系統(tǒng)很難得到理想的分離結(jié)果。要么分離時(shí)間太長(zhǎng)，要么分離度太差。梯度洗脫是指在分離過(guò)程中逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，使溶劑強(qiáng)度從分離開(kāi)始到結(jié)束逐漸增加的洗脫方式。即隨著時(shí)間改變，連續(xù)改變流動(dòng)相的極性，使復(fù)雜組分得到良好的分離。
梯度洗脫方式有兩類
1.外梯度洗脫外梯度洗脫又稱低壓梯度洗脫，即將溶劑在常壓下，通過(guò)程序控制器使溶劑按一定比例混合后再由高壓泵輸入到色譜柱。
2. 內(nèi)梯度洗脫內(nèi)梯度洗脫又稱高壓梯度淋洗，是將溶劑經(jīng)高壓泵加壓后再混合的洗脫方式。
梯度洗脫的特點(diǎn)
柱效提高；
2. 檢測(cè)器的靈敏度得到改善；
3. 當(dāng)復(fù)雜樣品中不同性質(zhì)成分的保留因子(k')相差很大(幾十倍至幾百倍)時(shí)，使用梯度洗脫可以得到更好的分離效果。
梯度范圍是指流動(dòng)相中強(qiáng)溶劑分別在起始液和終止液中的濃度。調(diào)節(jié)梯度范圍對(duì)得到最佳的梯度分離起重要作用。
注意事項(xiàng)
在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此必然帶來(lái)一些特殊的問(wèn)題，必須充分的重視。
1. 要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相有些溶劑在一定的比例內(nèi)互溶，超出一定的范圍后就不會(huì)互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸銨(pH5.16)做梯度洗脫，乙腈含量超過(guò)70%時(shí)就會(huì)出現(xiàn)不溶；當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖溶液混合時(shí)還可能析出鹽的結(jié)晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。
2. 梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭上后會(huì)被強(qiáng)的溶劑洗脫出來(lái)
3. 混合溶劑的黏度常隨組成而變化，因此在梯度洗脫時(shí)常會(huì)出現(xiàn)壓力變化例如純水或甲醇的黏度都比較小，但是當(dāng)二者以相近的比例混合時(shí)黏度會(huì)增大很多。因此要防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱所能承受的最大壓力。
4. 每一梯度洗脫程序完成后，必須對(duì)色譜柱進(jìn)行重新平衡，使其恢復(fù)到初始的狀態(tài)一般需要10～30倍柱容積的初始流動(dòng)相，使固定相和初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。
5. 注意梯度洗脫用水的有機(jī)物殘留往往在等度洗脫時(shí)用的水，在梯度洗脫時(shí)出現(xiàn)未知峰(“鬼峰”)。這是因?yàn)樵谔荻冗^(guò)程中，水的比例很高時(shí)流動(dòng)相洗脫能力很低，此時(shí)水中的有機(jī)物殘留就被色譜柱吸附并濃縮，當(dāng)強(qiáng)溶劑占高比例時(shí)，濃縮的有機(jī)物被高洗脫能力的流動(dòng)相洗脫而流出色譜柱，并成為一個(gè)色譜峰，從而干擾分析。
梯度洗脫程序及其模式
1.線性梯度
在梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相強(qiáng)度的變化與梯度時(shí)間成線性比例。在一定時(shí)間內(nèi)流動(dòng)相強(qiáng)度增加越大，直線斜率越大。
2.指數(shù)梯度
在梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相強(qiáng)度隨梯度時(shí)間變化稱指數(shù)關(guān)系。
凹形：梯度起始階段強(qiáng)度變化緩慢，隨時(shí)間增加，強(qiáng)度變化加快。
凸形：起始階段梯度速度變化快，終止階段梯度速度變化慢。
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